HEPENGBIO 食物總抗氧化能力（TAC）熒光法（ORAC）定量檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品說明書
主要用途
HEPENGBIO 食物總抗氧化能力（TAC）熒光法（ORAC）定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過使用熒光素探針， 受到有機(jī)氮自由基 AAPH 的破壞，但在抗氧化劑的存在下，得到抑制，由此通過熒光分光光度儀，觀察其峰值下降程度的變化，來定量檢測(cè)對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)水溶性生育酚Trolox 的總抗氧化能力，即消除自由基等值濃度的方法。適用于各種新鮮食物樣品總抗氧化能力檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基
（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡，甚而導(dǎo)致諸如冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。在生物系統(tǒng)內(nèi)，通過抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、銅藍(lán)蛋白（ceruloplasmin；CER）、鐵蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、類胡蘿卜素、抗壞血酸、還原性谷胱甘肽和尿酸膽紅素
（bilirubin）等，產(chǎn)生抗氧化能力，即捕獲自由基的能力，達(dá)到消除或降低ROS的損害。通過氧自由基吸光能力（oxygen radical absorbance capacity；ORAC），即使用熒光素（fluorescein）作為探針，2,2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride；AAPH）作為過氧自由基供體（peroxyl radical donor），其攻擊探針，產(chǎn)生熒光淬滅，一旦受到抗氧化劑作用，而防止熒光消失，由此評(píng)價(jià)抗氧化潛力和活性，也就是自由基去除作用（free radical scavenging），在熒光分光光度儀（激發(fā)波長(zhǎng)485nm±20，散發(fā)波長(zhǎng)528nm±20）的幫助下，觀察其峰值下降程度的變化，并與標(biāo)準(zhǔn)化抗氧化劑水溶性生育酚Trolox對(duì)照。
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO 清理液（Reagent A） 500 毫升
HEPENGBIO 緩沖液（Reagent B） 4 毫升
HEPENGBIO 染色液（Reagent C） 7.5 毫升
HEPENGBIO 氧化液（Reagent D） 1 管
HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E） 200微升
產(chǎn)品說明書 1 份
保存方式
保存 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）和 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent B）在 4℃冰箱里，其余的保存在
－20℃冰箱里，避免光照；有效保證 6 月
用戶自備
50 毫升燒杯：用于樣品操作的容器
15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5 毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品配制的容器
4℃臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
200 微升 1 厘米光徑比色皿或黑色 96 孔板：用于熒光分析的容器熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、 樣品準(zhǔn)備
1、固態(tài)食品處理
1. 秤取 1 克固態(tài)食品或粉末到 50 毫升燒杯，杯口封口膜密封
2. 加入 8 毫升
HEPENGBIO 清理液（Reagent A）
3. 攪拌 30 分鐘，充分混勻
4. 繼續(xù)加入
HEPENGBIO 清理液（Reagent A）到終容量為 10 毫升
5. 過濾紙過濾，去除不溶性固體顆粒
6. 封口膜封口備用
2、液態(tài)食品處理
1. 移取 5 毫升待測(cè)液態(tài)食品到 15 毫升錐形離心管
2. 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 1500g
3. 移取上清液到新的 15 毫升錐形離心管
4. （選擇步驟）可以加入適量的
HEPENGBIO 清理液（Reagent A）
5. （選擇步驟）過濾紙過濾（如果離心處理，樣品仍然不清澈）
6. 置于冰槽里備用或放進(jìn)-20 冰箱里保存
二、標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)備
1. 準(zhǔn)備好 5 個(gè) 1.5 毫升離心管，標(biāo)記為 1 至 5 號(hào)管
2. 分別加入 50 微升
HEPENGBIO 緩沖液（Reagent B）到 2 至 5 號(hào)管
3. 移取 100 微升
HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到 1 號(hào)管，混勻
4. 小心移取 50 微升 1 號(hào)管的
HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到 2 號(hào)管，混勻
5. 小心移取 50 微升 2 號(hào)管稀釋的
HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到 3 號(hào)管，混勻
6. 小心移取 50微升 3 號(hào)管稀釋的
HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到 4 號(hào)管，混勻
7. 將 1 至 5 號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表
| 管號(hào) |
HEPENGBIO 緩沖液（Reagent B） |
HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent
E） |
測(cè)定體系
標(biāo)準(zhǔn) Trolox 濃度 |
| 1 |
0 |
100 微升 |
1微摩爾/升 |
| 2 |
50 微升 |
50 微升 |
0.5 微摩爾/升 |
| 3 |
50 微升 |
50 微升 |
0.25 微摩爾/升 |
| 4 |
50微升 |
50 微升 |
0.125 微摩爾/升 |
| 5 |
50微升 |
0 |
0 |
三、 樣品測(cè)讀
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化，移取 1.5 毫升
HEPENGBIO 緩沖液（Reagent B） 到 1 管
HEPENGBIO 氧化液（Reagent D）里，混勻，置于暗室里，標(biāo)記為
HEPENGBIO 氧化工作液，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。
1. 準(zhǔn)備 1 個(gè)黑色 96 孔板，做好標(biāo)記：最大對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)樣品孔、待測(cè)樣品孔
2. 分別移取 150 微升
HEPENGBIO 染色液（Reagent C）到黑色 96 孔板里的每個(gè)孔里
3. 加入 25 微升
HEPENGBIO 緩沖液（Reagent B）到最大對(duì)照孔
4. 加入 25 微升上述配制的
HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)樣品孔里
5. 加入 25 微升樣品（100 微克食品總量）到待測(cè)樣品孔里
6. 放進(jìn) 37℃培養(yǎng)箱里孵育 30 分鐘
7. 分別加入 25 微升
HEPENGBIO 氧化工作液到標(biāo)準(zhǔn)樣品孔和待測(cè)樣品孔里
8. 加入 25 微升
HEPENGBIO 緩沖液（Reagent B）到最大對(duì)照孔
9. 輕輕搖動(dòng)黑色 96 孔板，使其混勻
10. 放進(jìn) 37℃培養(yǎng)箱里孵育 15 分鐘
11. 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀里測(cè)讀：激發(fā)波長(zhǎng) 485nm±20，散發(fā)波長(zhǎng) 528nm±20，增益倍數(shù)25至100
12. 分析結(jié)果：
1. 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱坐標(biāo)(Y軸）為熒光單位;橫坐標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)Trolox濃度（微摩爾/升）
2. 最大對(duì)照孔為最大熒光單位讀數(shù)
3. 標(biāo)準(zhǔn)樣品孔和待測(cè)樣本孔為實(shí)際熒光單位讀數(shù)
4. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)Trolox濃度（微摩爾/升）
5. 計(jì)算樣品實(shí)際總抗氧化能力
【根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)Trolox濃度（微摩爾/升）X0.2（體系容量;毫升）X樣品稀釋倍數(shù)】÷0.025（樣品容量;毫升）=（微摩爾/升Trolox等值）
6. 根據(jù)下列公式計(jì)算測(cè)定體系中樣品量的總抗氧化能力（實(shí)際抑制百分率）
【實(shí)際熒光單位讀數(shù)÷最大對(duì)照孔熒光單位讀數(shù)】X100%
7. IC50:50%抑制率所需的樣品單位：Trolox 等值（微摩爾/升）或樣品重量（毫克/毫升）或樣品容量（微升）
X(所需樣品單位）=（已知樣品單位÷實(shí)際抑制百分率）X50%
注意事項(xiàng)
1. 本產(chǎn)品為 50 次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)品
2. 本產(chǎn)品測(cè)試范圍為 100 納摩爾至 1 微摩爾 Trolox 等值
3. 操作時(shí)，須戴手套
4. 樣品制備的所有操作均須在 4℃狀態(tài)下進(jìn)行
5. 建議復(fù)孔操作
6. 用戶可以調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線區(qū)間,尤其出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)5號(hào)管讀數(shù)大于4號(hào)管讀數(shù)時(shí)
7. 測(cè)試前，樣品須新鮮收集
8. 樣品須清澈
9. 樣品讀數(shù)越高，下降程度越小，抗氧化能力越高
10. 可以使用比色皿檢測(cè)
11. 如果樣品抗氧化劑濃度過高或過低， 建議稀釋或增加樣品容量或濃度
12. 如果測(cè)試樣品很多，建議使用排槍移液
13. 本公司提供系列抗氧化分析試劑產(chǎn)品
