鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進一步分成具有活性的復合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運輸、釋放神經(jīng)傳導介質(zhì)、信使傳導等方面起著重要作用。鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求。Fluo-4，一種與鈣離子結(jié)合，其熒光強度迅速增強100倍的熒光探針，可以敏感測定微量游離鈣離子水平。在熒光分光光度儀下，激發(fā)波長485nm，散發(fā)波長520nm，來定量測定組織細胞的鈣濃度。
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A）      毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO反應液（Reagent C）      毫升
HEPENGBIO飽和液（Reagent D）      毫升
HEPENGBIO陰性液（Reagent E）      毫升
產(chǎn)品說明書    1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；HEPENGBIO反應液（Reagent C）避免光照；有效保證6月
 
用戶自備
 
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
DOUNCE勻漿器：用于樣品制備
超聲儀：用于樣品制備
微型臺式離心機：用于樣品沉淀
培養(yǎng)箱：用于反應物孵育
黑色96孔板：用于樣品熒光測定的容器
熒光酶標儀：用于樣品熒光分析
 
實驗步驟
 
一、 樣品準備
 
1． 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
2． （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入到一個液氮凍存管
5． 即刻放進液氮罐過夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進一個15毫升錐形離心管
8． 加入預冷的xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 
9． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
10． 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
11． 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）
12． （或超聲處理：100瓦，10秒一次，間隔1分鐘，重復3次）
13． 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管
14． 轉(zhuǎn)移到預冷的1.5毫升離心管
15． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
16． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
17． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
18． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
 
二、 測定準備
 
1． 準備好上述制備的待測樣品，置于冰槽里備用
2． 設定好熒光酶標儀（22℃）：激發(fā)波長485nm，散發(fā)波長520nm
 
三、熒光測定
 
1． 準備1個黑色96孔板，標記為：樣品孔、空白對照孔、最大對照空
2． 移取100微升（20微克蛋白）上述制備的樣品到樣品孔里
3． 移取xx微升HEPENGBIO飽和液（Reagent D）到最大對照空里
4． 移取xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent E）到空白對照空
5． 分別加入xx微升HEPENGBIO反應液（Reagent C）到所有孔里
6． 輕輕搖動黑色96孔板，混勻
7． 室溫下（22℃），孵育30分鐘，避免光照
8． 即刻放進熒光酶標儀測讀：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU） 
9． 計算樣品鈣離子濃度：納摩爾（注意：不要遺忘乘上稀釋倍數(shù)）